PCR, es la reacción en cadena de la polimerasa, que se refiere a la adición de dNTP, Mg2+, factores de elongación y factores de mejora de la amplificación al sistema bajo la catálisis de la ADN polimerasa, utilizando el ADN original como plantilla y cebadores específicos como punto de partida de la extensión. A través de los pasos de desnaturalización, hibridación, extensión, etc., el proceso de replicación in vitro del ADN de la cadena hija complementario al ADN plantilla de la cadena principal puede amplificar rápida y específicamente cualquier ADN objetivo in vitro.
1. PCR de inicio en caliente
El momento de inicio de la amplificación en la PCR convencional es no colocar la máquina de PCR en la máquina de PCR y luego el programa comienza a amplificar.Cuando se completa la configuración del sistema, comienza la amplificación, lo que puede causar una amplificación no específica, y la PCR de inicio en caliente puede resolver este problema.
¿Qué es la PCR de arranque en caliente?Una vez preparado el sistema de reacción, el modificador enzimático se libera a alta temperatura (generalmente superior a 90 °C) durante la etapa de calentamiento inicial de la reacción o etapa de "inicio en caliente", de modo que se activa la ADN polimerasa.El tiempo y la temperatura exactos de activación dependen de la naturaleza de la ADN polimerasa y del modificador de arranque en caliente.Este método utiliza principalmente modificadores como anticuerpos, ligandos de afinidad o modificadores químicos para inhibir la actividad de la ADN polimerasa.Dado que la actividad de la ADN polimerasa se inhibe a temperatura ambiente, la tecnología de inicio en caliente proporciona una gran comodidad para preparar múltiples sistemas de reacción de PCR a temperatura ambiente sin sacrificar la especificidad de las reacciones de PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (PCR de transcripción inversa) es una técnica experimental para la transcripción inversa de ARNm a ADNc y su uso como plantilla para la amplificación.El procedimiento experimental consiste en extraer primero el ARN total en tejidos o células, usar Oligo (dT) como cebador, usar transcriptasa inversa para sintetizar ADNc y luego usar ADNc como plantilla para la amplificación por PCR para obtener el gen objetivo o detectar la expresión génica.
3. PCR cuantitativa fluorescente
PCR cuantitativa fluorescente (PCR cuantitativa en tiempo real,RT-qPCR) se refiere al método de agregar grupos fluorescentes al sistema de reacción de PCR, usar la acumulación de señales fluorescentes para monitorear todo el proceso de PCR en tiempo real y, finalmente, usar la curva estándar para analizar cuantitativamente la plantilla.Los métodos qPCR más utilizados incluyen SYBR Green I y TaqMan.
4. PCR anidada
La PCR anidada se refiere al uso de dos conjuntos de cebadores de PCR para dos rondas de amplificación por PCR, y el producto de amplificación de la segunda ronda es el fragmento del gen diana.
Si una falta de coincidencia del primer par de cebadores (cebadores externos) provoca que se amplifique un producto no específico, la posibilidad de que el segundo par de cebadores reconozca la misma región no específica y continúe ampliificándose es muy pequeña, por lo que la amplificación por el segundo par de cebadores, se ha mejorado la especificidad de la PCR.Una ventaja de realizar dos rondas de PCR es que ayuda a amplificar suficiente producto a partir de un ADN inicial limitado.
5. PCR de aterrizaje
Touchdown PCR es un método para mejorar la especificidad de la reacción de PCR ajustando los parámetros del ciclo de PCR.
En la PCR de aterrizaje, la temperatura de recocido para los primeros ciclos se establece unos grados por encima de la temperatura máxima de recocido (Tm) de los cebadores.Una temperatura de hibridación más alta puede reducir eficazmente la amplificación no específica, pero al mismo tiempo, una temperatura de hibridación más alta agravará la separación de los cebadores y las secuencias diana, lo que dará como resultado un rendimiento de PCR reducido.Por lo tanto, en los primeros ciclos, la temperatura de hibridación generalmente se establece para que disminuya 1 °C por ciclo para aumentar el contenido del gen diana en el sistema.Cuando la temperatura de recocido se reduce a la temperatura óptima, la temperatura de recocido se mantiene durante los ciclos restantes.
6. PCR directa
La PCR directa se refiere a la amplificación del ADN diana directamente de la muestra sin necesidad de aislamiento y purificación del ácido nucleico.
Hay dos tipos de PCR directa:
método directo: tome una pequeña cantidad de muestra y agréguela directamente a PCR Master Mix para su identificación por PCR;
Método de craqueo: después de tomar muestras de la muestra, agréguela al lisado, lísela para liberar el genoma, tome una pequeña cantidad de sobrenadante lisado y agréguela a la PCR Master Mix, realice la identificación por PCR.Este enfoque simplifica el flujo de trabajo experimental, reduce el tiempo práctico y evita la pérdida de ADN durante los pasos de purificación.
7. PCR de empresas estatales
El empalme de genes mediante PCR de extensión superpuesta (SOE PCR) utiliza cebadores con extremos complementarios para hacer que los productos de la PCR formen cadenas superpuestas, de modo que en la reacción de amplificación posterior, a través de la extensión de las cadenas superpuestas, se superpongan diferentes fuentes de Una técnica en la que se superponen fragmentos amplificados y empalmados.Actualmente, esta tecnología tiene dos direcciones de aplicación principales: construcción de genes de fusión;mutación dirigida al sitio del gen.
8. IPCR
La PCR inversa (IPCR) utiliza cebadores complementarios inversos para amplificar fragmentos de ADN distintos de los dos cebadores y amplifica secuencias desconocidas en ambos lados de un fragmento de ADN conocido.
IPCR se diseñó originalmente para determinar la secuencia de regiones desconocidas adyacentes y se utiliza principalmente para estudiar secuencias de promotores de genes;reordenamientos cromosómicos oncogénicos, tales como fusión, translocación y transposición de genes;y la integración de genes virales, también se usan comúnmente ahora. Para la mutagénesis dirigida al sitio, copie un plásmido con la mutación deseada.
9. dPCR
La PCR digital (dPCR) es una técnica para la cuantificación absoluta de moléculas de ácido nucleico.
Actualmente existen tres métodos para la cuantificación de moléculas de ácidos nucleicos.La fotometría se basa en la absorbancia de las moléculas de ácido nucleico;La PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real (PCR en tiempo real) se basa en el valor de Ct, y el valor de Ct se refiere al número de ciclo correspondiente al valor de fluorescencia que se puede detectar;La PCR digital es la última tecnología cuantitativa basada en el método de PCR de una sola molécula para contar la cuantificación de ácidos nucleicos es un método cuantitativo absoluto.
Hora de publicación: 13 de junio de 2023