Uso y precauciones del tubo centrífugo de ultrafiltración.
1) Elija un tubo de ultrafiltración adecuado.Tenga en cuenta que las membranas UF difieren en su nivel de tolerancia a diversos productos químicos.Normalmente, los tubos de ultrafiltración con un límite de peso molecular de 10 kDa se pueden seleccionar con un límite de peso molecular que no debe ser mayor que 1/3 del peso molecular de la proteína de interés, tal como 35 kDa.Si el peso molecular de la proteína de interés es de alrededor de 10 kD, se puede utilizar un tubo de ultrafiltración con un límite de peso molecular de 3 KD.
(2) La ultrafiltración, recién comprada, es seca, con agua ultrapura añadida antes de su uso y agua pasada completamente por la membrana, baño de hielo o frigorífico preenfriada durante unos minutos.Luego se vierte el agua, es decir, el líquido proteico, y se indica la cantidad que se añade, lo que no supere la línea blanca en la parte superior del tubo.La operación es ligera y el tubo de ultrafiltración debe enfriarse previamente en hielo antes de agregar la solución de proteína.
3) Tanto la masa como el centro de gravedad debían alcanzar el equilibrio.Tenga en cuenta que la velocidad de rotación y la aceleración no son muy rápidas, de lo contrario se dañaría directamente la membrana de ultrafiltración.Se inició la ultrafiltración centrífuga (centrifugación preenfriada a 4 grados).Después de que las RPM de diferentes centrífugas se convirtieron a g, fueron diferentes.La aceleración de la centrífuga se ajustó al mínimo, reduciendo la presión sobre la membrana.Tenga en cuenta que asegúrese de dejar la centrífuga después de que haya alcanzado su velocidad de destino o, si tiene un problema, no podrá manejarla por primera vez.La orientación de la membrana con respecto al husillo se ajustó de acuerdo con las instrucciones (la caja de la centrífuga angular es la membrana al eje perpendicular).En el uso práctico, la velocidad de rotación general es menor que la indicada en las instrucciones, por lo que se puede extender la vida útil del tubo centrífugo.
3) Tanto la masa como el centro de gravedad debían alcanzar el equilibrio.Tenga en cuenta que la velocidad de rotación y la aceleración no son muy rápidas, de lo contrario se dañaría directamente la membrana de ultrafiltración.Se inició la ultrafiltración centrífuga (centrifugación preenfriada a 4 grados).Después de que las RPM de diferentes centrífugas se convirtieron a g, fueron diferentes.La aceleración de la centrífuga se ajustó al mínimo, reduciendo la presión sobre la membrana.Tenga en cuenta que asegúrese de dejar la centrífuga después de que haya alcanzado su velocidad de destino o, si tiene un problema, no podrá manejarla por primera vez.La orientación de la membrana con respecto al husillo se ajustó de acuerdo con las instrucciones (la caja de la centrífuga angular es la membrana al eje perpendicular).En el uso práctico, la velocidad de rotación general es menor que la indicada en las instrucciones, por lo que se puede extender la vida útil del tubo centrífugo.
(4) Cuando se concentre hasta el 1 ml restante, tome 50 ul de solución tampón, agregue 10 ul de flujo y observe si hay algún color azul, para determinar si al tubo de ultrafiltración le falta proteína.Si el tubo tiene fugas, vuelva a verter la capa superior y fluya hacia un tubo nuevo para comenzar la ultrafiltración.Para determinar con precisión si se omitieron tubos, centrifugue durante 10 minutos con 5 mg ml de BSA antes del flujo, utilizando pegamento proteico o ensayo crudo de Bradford, y continúe agregando la solución de proteína concentrada restante (que opera en hielo y evita que las proteínas se calienten) hasta Se ha agregado todo el concentrado.Tenga cuidado durante la centrifugación si se produce precipitación de proteínas, lo que provocaría el cierre del tubo.Si se produce precipitación, determine si la causa específica de la precipitación es una concentración excesiva de proteínas o un tampón inadecuado;Lo primero se puede solucionar mediante ultrafiltración de múltiples tubos de ultrafiltración simultáneamente, disminuyendo la concentración, y lo segundo intercambiando diferentes soluciones tampón hasta que no se produzca precipitación de la proteína.
(4) Cuando se concentre hasta el 1 ml restante, tome 50 ul de solución tampón, agregue 10 ul de flujo y observe si hay algún color azul, para determinar si al tubo de ultrafiltración le falta proteína.Si el tubo tiene fugas, vuelva a verter la capa superior y fluya hacia un tubo nuevo para comenzar la ultrafiltración.Para determinar con precisión si se omitieron tubos, centrifugue durante 10 minutos con 5 mg ml de BSA antes del flujo, utilizando pegamento proteico o ensayo crudo de Bradford, y continúe agregando la solución de proteína concentrada restante (que opera en hielo y evita que las proteínas se calienten) hasta Se ha agregado todo el concentrado.Tenga cuidado durante la centrifugación si se produce precipitación de proteínas, lo que provocaría el cierre del tubo.Si se produce precipitación, determine si la causa específica de la precipitación es una concentración excesiva de proteínas o un tampón inadecuado;Lo primero se puede solucionar mediante ultrafiltración de múltiples tubos de ultrafiltración simultáneamente, disminuyendo la concentración, y lo segundo intercambiando diferentes soluciones tampón hasta que no se produzca precipitación de la proteína.
(5) Los primeros pasos se utilizan para concentrar la proteína y, si se va a cambiar el tampón, agregue suavemente un nuevo tampón (ultrafiltración a través de una membrana de ultrafiltración de 0,22 µm) a aproximadamente 1 ml de proteína total y reconcentre a aproximadamente 1 ml durante tres veces consecutivas, dependiendo el volumen final concentrado de la concentración de proteína deseada, generalmente no más de 500 ul, pero también dentro de 200 ul.Logre 1000 × o más en tres ocasiones, esencialmente el mismo cambio de tampón, calculado por al menos 10 × aproximadamente un enriquecimiento de volumen cada vez.
(5) Los primeros pasos se utilizan para concentrar la proteína y, si se va a cambiar el tampón, agregue suavemente un nuevo tampón (ultrafiltración a través de una membrana de ultrafiltración de 0,22 µm) a aproximadamente 1 ml de proteína total y reconcentre a aproximadamente 1 ml durante tres veces consecutivas, dependiendo el volumen final concentrado de la concentración de proteína deseada, generalmente no más de 500 ul, pero también dentro de 200 ul.Logre 1000 × o más en tres ocasiones, esencialmente el mismo cambio de tampón, calculado por al menos 10 × aproximadamente un enriquecimiento de volumen cada vez.
Hora de publicación: 09-nov-2022